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ラボ用質量分析LC-MS/MSのマトリクス効果補正と内部標準選定

LC-MS/MSにおけるマトリクス効果とは

質量分析法であるLC-MS/MS（液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析法）は、微量成分の検出や定量分析に用いられる高感度・高選択性を持つ分析技術です。

しかし、実際の生体試料や環境サンプルなど、複雑な組成を持つマトリクス中での分析では、「マトリクス効果」と呼ばれる現象が問題となります。

これは、共存する他成分や試料由来の夾雑物が、ターゲット化合物のイオン化効率に影響し、シグナルの増強や抑制を引き起こす現象です。

マトリクス効果が強く現れると、定量精度や正確性が大きく損なわれ、信頼性の高い分析結果が得られなくなります。

マトリクス効果の原因

マトリクス効果の主な原因は、サンプル中に存在する共存物質がESI（エレクトロスプレーイオン化）やAPCI（大気圧化学イオン化）といったイオン化過程に影響することにより発生します。

特に、リン脂質やタンパク質分解物、塩類、有機酸、糖類などがイオン化源でのイオン化反応を妨害したり、補助したりすることで、標的物質の検出感度にばらつきをもたらします。

また、マトリクス成分と標的物質の競合吸着、水素結合、疎水性相互作用なども一因となります。

マトリクス効果の種類

マトリクス効果には、以下の2種類があります。

・イオン化増強（イオン化の促進）
・イオン化抑制（イオン化効率の低下）

マトリクス成分がターゲット化合物のイオン化を促進する場合はシグナルが増幅し、逆に抑制する場合はシグナルが減少します。

どちらの現象も、分析精度に悪影響を与えるため、分析法バリデーション時にはマトリクス効果の評価が必須です。

マトリクス効果の補正方法

LC-MS/MSにおけるマトリクス効果の補正は、定量精度を維持するため非常に重要なプロセスです。

主な補正方法として、以下が挙げられます。

1. 標準添加法（スパイクリカバリー法）

マトリクスの影響を補正する伝統的な方法が、標準添加法です。

これは、未知試料に既知濃度の標準化合物を添加し、得られたシグナル増加から分析対象成分の含有量を算出する方法です。

この手法では、標準物質が分析対象サンプルの中で標的物質と同じ条件下に置かれるため、現実的なマトリクス効果を反映した定量が可能となります。

2. マトリクス適合標準溶液の利用

サンプルと同じ、もしくは類似マトリクスを用いて標準溶液（キャリブレーションカーブ作成用）を調製する方法です。

溶媒のみの標準カーブではなく、サンプルからターゲット物質を除去したマトリクスに標準を添加した溶液で検量線を作成します。

これにより、実試料中でのマトリクス影響を反映したキャリブレーションが可能になり、より正確な定量が行えます。

3. 内部標準物質の利用

最も強力なマトリクス効果補正方法が、内部標準（Internal Standard、IS）法の利用です。

内部標準物質を各サンプル、標準溶液、QC（クオリティコントロール）サンプルに一定量添加し、ターゲット物質検出シグナルを内部標準のシグナルで補正します。

内部標準は、マトリクスの影響だけでなく、試料調製過程やイオン化効率の変動に関する補正も同時に実現できるメリットがあります。

内部標準の選定基準と種類

LC-MS/MSで内部標準を用いる際には、“どんな物質を選ぶか”が重要です。

理想的な内部標準とは、次の特徴を持ちます。

内部標準選定のポイント

・ターゲット化合物と化学構造、物理化学的特性が類似している
・サンプル中に内在しない（外来の物質である）
・LC（クロマトグラフィー）分離特性がターゲット化合物と近似している
・MS（質量分析）で識別（判別）が容易で、干渉がない
・サンプル調製や前処理、イオン化過程で同等レベルの挙動を示す

この基準を満たすことで、マトリクス効果や調製工程の影響を的確に補正できます。

安定同位体標識内部標準（Stable Isotope Labeled Internal Standard, SIL-IS）

最も推奨される内部標準が、ターゲット分析物の安定同位体標識体（SIL-IS）です。

例えば、同位体ラベル（13C、2H、15Nなど）で重くなった同一化合物を用いることで、標的物質とほぼ完全に同じ物理化学特性、クロマト分離特性、イオン化特性を持ちます。

そのため、サンプル調製や分析中の変動を、ほぼ完全に補正可能です。

現代のLC-MS/MS分析では、できる限りSIL-ISを内部標準として採用することがゴールドスタンダードとなっています。

アナログ内部標準（構造類似体、異物質）

SIL-ISが利用できない場合は、ターゲット物質と構造が似たアナログ化合物（構造類似体）や、質量数やクロマトグラフ挙動がターゲット物質と近似した他の外来化合物を用いる場合があります。

この場合も、ターゲット物質と物性がより近いものを選ぶことで補正効果が高まりますが、完全な補正は困難な場合もあるため注意が必要です。

マトリクス効果評価の具体的手順

マトリクス効果を実際に評価するには、以下のような手順となります。

1. 標準溶液（溶媒）とマトリクス添加標準の比較

溶媒中で調製した標準溶液（通常のキャリブレーションカーブ作成用）と、マトリクスを調整してターゲット物質を添加したものの応答を比較します。

このとき、一定濃度のターゲット物質を溶媒中およびマトリクス中で測定し、得られたピーク面積やピーク高さの比率からマトリクス効果（％）を算出します。

例えば、以下の式を用います。

マトリクス効果（ME,%） = （マトリクス中の応答 / 溶媒中の応答） × 100

2. 内部標準物質での補正式

ターゲット物質と内部標準（IS）のシグナル比を用いて分析します。

ターゲットの応答値をISの応答値で割り、さらにマトリクス中と溶媒中の比率からマトリクス効果を評価します。

これにより、実際の定量検量線やサンプル分析時の補正値として活用できます。

質量分析におけるマトリクス効果低減の工夫

マトリクス効果を根本的に抑えるためには、分析条件やサンプル前処理にも改良が求められます。

よく用いられるアプローチを紹介します。

固相抽出（SPE）や液液抽出の利用

LC-MS/MSサンプル調製時に、固相抽出（SPE：Solid Phase Extraction）や液液抽出などの前処理を組み合わせて、マトリクス成分の分離・除去を図ります。

これにより、イオン源に持ち込まれるマトリクス成分の量が減らせるため、マトリクス効果の低減が期待できます。

クロマトグラフィー分離条件の最適化

LC（液体クロマトグラフ）の移動相、カラム種類、分離条件（時間、温度等）を最適化し、ターゲット物質とマトリクス成分の保持時間（リテンションタイム）をずらすことで、干渉を低減できます。

カラム選択や勾配条件の変更によって、よりクリーンなシグナルが得やすくなります。

イオン源や分析装置の最適設定

ESIやAPCIといったイオン化モードの切り替え、インレット温度や電圧、ガス流量の最適化などでも、マトリクス効果の緩和が進みます。

特にイオン源のクリーニングや定期的なメンテナンスも、感度維持とマトリクス効果低減には重要です。

LC-MS/MS定量分析におけるバリデーションと報告

マトリクス効果補正や内部標準の運用は、LC-MS/MS分析のバリデーション時にも明記すべき重要項目です。

分析バリデーションでは、以下の項目の評価が求められます。

・マトリクス効果（ME%）の評価および補正法
・内部標準の種類、補正根拠、濃度
・標準物質の調製方法
・再現性、回収率、定量下限（LLOQ）といった分析性能指標

また、論文や分析報告書作成時も、マトリクス効果の有無・数値・対応方法を明記し、データの信頼性を担保することが重要です。

まとめ

LC-MS/MS分析を活用した高精度な定量法を実現するには、サンプルマトリクスによるイオン化抑制や増強といった「マトリクス効果」を的確に補正する必要があります。

標準添加法やマトリクス適合キャリブレーション、そして特に効果の高い内部標準物質（安定同位体標識体）の利用など、実践的なアプローチを組み合わせることで、正確・精密な分析が可能となります。

同時に、前処理や分析装置の最適化とともに、マトリクス効果の評価とその補正方法を明確にしたバリデーション・報告が、ラボでの信頼性あるデータ創出につながります。

LC-MS/MSを使った高度な分析を目指す研究者・技術者は、マトリクス効果と内部標準選定のテクニックをしっかり押さえ、最高レベルの分析品質の確立を目指してください。